В настоящее время в этой области достигнуты значительные успехи. Наиболее важным на наш взгляд, является создание уникальной по своей оригинальности конструкции клапана. Поскольку клапаны в подобных системах являются критически важным звеном, обычные электромеханические клапаны любой конструкции имеют достаточно большие размеры и сложность, делающую невозможным их использование для регулирования крайне малых потоков в клапанах субмиллиметрового сечения, тем более в многоканальных системах. Сущность принципа функционирования нового "клапана" напоминает устройство полевого транзистора. Ток, приложенный перпендикулярно каналу, тормозит электроосмотическое перемещение жидкости по нему. "Клапан" не содержит каких-либо движущихся частей. Может быть эффективно использован для регулирования потока по каналам любого размера. Field-effect flow control for microfabricated fluidic networks. Richard B. M. Schasfoort, Stefan Schlautmann, Jan Hendrikse, Albert van den Berg. SCIENCE 1999, 286:942-945.
Первый предусматривает перемещение мономеров к поверхности чипа из резервуаров по специальным каналам, выпускные отверстия, в которых непосредственно контактируют с поверхностью чипа. Тогда для обеспечения эффективного синтеза необходимо наличие максимального количества каналов, каждый из которых должен быть соединён со всеми четырьмя резервуарами. Выбор того, какой мономер будет депонирован этим каналом, требует наличия системы клапанов в местах соединения канала с резервуарами нуклеотидов. Всего таких клапанов на каждый канал требуется четыре. Для управления клапанами также должна быть использована соответствующая, обычно электромеханическая, система. Одновременно может быть открыт только один из 4-х клапанов, соответствующий тому резервуару, в котором находится мономер, необходимый для депонирования в этой точке чипа в данном цикле. Подобная система имеет как преимущества, так и недостатки. Главным преимуществом является возможность одновременного синтеза нескольких нуклеотидов, количество которых равно количеству каналов размещающего устройства. Соответственно чем больше их число, тем быстрее будет осуществляться синтез. Недостатком этого метода синтеза является сложность размещающего устройства. Главным образом необходимость создания трёхмерной сети каналов. Современные методы синтеза твёрдофазных структур, заимствованные из микроэлектроники и микромеханики позволяют решать подобные задачи. Причём эти методы уже довольно давно (с 1992 г.) используются для создания миниатюрных устройств в различных областях аналитической химии, в том числе и аналитической биохимии и, что особенно важно, в молекулярной диагностике, где они обычно используются для осуществления ПЦР и/или электрофоретической сепарации продуктов амплификации.
Преимуществом такого подхода является его простота, отсутствие необходимости в сложном оборудовании. Но эта группа методов имеет существенные недостатки, обусловленные невозможностью одновременного синтеза большого количества нуклеотидов. Лимитирующим фактором здесь является проблема доставки активированных нуклеотидов в определённую точку поверхности чипа. Таким образом, метод требует доставки готовых мономеров к месту сборки полимерной цепи. Эта необходимость сводит на нет преимущества in situ синтеза, заключающегося в возможности параллельного синтеза всех нуклеотидов. Необходимость адресации мономеров связана с тем, что все растущие полинуклеотидные цепи при использовании этого метода одинаковы по своей возможности присоединить нуклеотид. То есть любой иммобилизованный полинуклеотид может в стадию присоединения быть соединён с любым нуклеотидом, находящимся в растворе. Поэтому и возникает необходимость пространственно разграничить участки присоединения каждого мономера. Технически решение этой задачи может быть осуществлено самыми различными способами. Но способ решения этой проблемы не снимает принципиальных ограничений данного метода. В любом случае для доставки мономеров к пространственно разграниченным областям чипа, необходимы система физически раздельного хранения мономеров и система их доставки, в которой мономеры не смешивались бы между собой. Путей решения этой проблемы принципиально возможно всего два.
Схема фосфорамидитного метода синтеза полинуклеотидов:
Последовательный подход предусматривает использование обычного фосфорамидитного метода синтеза полинуклеотидов. При этом реагенты (5' защищенные - 3' фосфорамидитактивированные нуклеотиды) наносятся на необходимые точки (ячейки чипа).
Существуют два подхода синтеза чипов in situ: последовательный и параллельный.
Наиболее прогрессивное направление в синтезе ДНК-чипов - это синтез олигонуклеотидов непосредственно на поверхности чипа ('on-chip') путем поэтапного добавления нуклеотидов к растущему концу цепи. Это направление более эффективно, чем использование предварительно синтезированных полинуклеотидов, так как предполагает возможность одновременного синтеза всех полинуклеотидов, размещаемых на чипе.
Технологии синтеза ДНК чипов. In situ синтез - синтез на поверхности чипа.
Комментариев нет:
Отправить комментарий